Man gibt eine kleine Menge der zu trennenden Substanz als punktförmigen Tropfen oder kurzen Strich aus einer Kapillare auf eine dünne Schicht aus sehr feinkörnigem Material (z. B. Kieselgel, Aluminiumoxid, Cellulose), das Trennschicht oder auch stationäre Phase genannt wird. Diese Trennschicht ist sehr gleichmäßig auf eine Trägerplatte oder Trägerfolie aus Kunststoff, Aluminiumblech oder Glas aufgetragen und kommerziell in unterschiedlichen Schichtdicken erhältlich.

Nun stellt man dieses Trennsystem senkrecht in ein Gefäß mit einem geeigneten Fließmittel, der mobilen Phase, in die die DC-Platte zu einem kleinen Teil eintaucht. Das Fließmittel wird nun in die stationäre Phase nach oben gesaugt und reißt die aufgetropfte Testsubstanz mit.

Durch unterschiedliche Wechselwirkungen der Komponenten des aufgetragenen Gemischs mit der stationären und der mobilen Phase trennt sich die Mischung auf. Um eine Beeinflussung der Ergebnisse durch das Verdampfen des Fließmittels zu verhindern, führt man die Trennung in einer mit dem Fließmittel gesättigten Atmosphäre in einem geschlossenen Gefäß durch.

Die getrennten Substanzen müssen in der Regel durch Besprühen mit Reagenzien sichtbar gemacht (detektiert) werden. Manche Träger enthalten Zusätze, die in dem UV-Licht fluoreszieren und an denjenigen Stellen dunkle Fluoreszenzquenchung zeigen, an denen sich die getrennten Stoffe befinden. Auch die Eigenfluoreszenz bestimmter Stoffe oder anderes Merkmalen wie Radioaktivität können zur Detektion herangezogen werden.

Wenn man die Trennung mit einer bekannten Vergleichssubstanz auf dem Träger in dem gleichen Lauf durchführt, kann man mit einiger Wahrscheinlichkeit nachweisen, dass diese Substanz in dem Analysegemisch enthalten war. Durch mehrdimensionale Entwicklung (die Platte wird nachdem ersten Fließmittellauf um 90 ° gedreht) oder Nutzung mehrerer Fließmittelsysteme kann die Erkennungswahrscheinlichkeit erheblich gesteigert werden. Für genau reproduzierbare Trennungen sind Automaten entwickelt worden.

Die DC (engl.: TLC Thin Layer Chromatography, frz.: CCM) kann auch präparativ genutzt werden. Hierzu werden auf dickere stationäre Phasen relativ große Mengen der zu trennenden Substanzmischung in einem Strich aufgetragen. Nach dem Trennlauf bilden sich idealerweise zwei oder drei völlig voneinander getrennte Striche in verschiedenen Höhen, die dann z.B. durch mechanisches Abkratzen in verschiedene Gefäße verteilt und separat eluiert werden.

Im Gegensatz zu den leistungsfähigeren Chromatographie-Verfahren wie Gaschromatographie und HPLC kommt die DC mit kleinem apparativen Aufwand aus und stellt sich als schnelles, vielseitiges und preiswertes Analyseverfahren dar, das auch außerhalb des Labors genutzt werden kann.

• Aminosäuren mittels DC und Ninyhdrin http://www.uni-bayreuth.de/departments/didaktikchemie/umat/ninhydrin/ninhydrin.htm